一、引言

基因治療作為一種新興的治療策略，在治療多種遺傳性和獲得性疾病方面展現(xiàn)出巨大的潛力。其中，安全高效的基因載體是基因治療成功的關(guān)鍵因素之一。傳統(tǒng)的病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率高，但存在免疫原性、潛在的致瘤性等嚴(yán)重問(wèn)題。非病毒載體，如脂質(zhì)體和聚合物納米粒，由于其低免疫原性和易于合成等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。

硅納米材料因其良好的生物相容性、易于表面修飾等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。多聚賴氨酸是一種具有良好生物相容性且?guī)д姾傻木酆衔铮軌蚺c帶負(fù)電荷的核酸分子通過(guò)靜電相互作用結(jié)合。將多聚賴氨酸與硅納米材料結(jié)合，可以制備出一種新型的納米載體，有望實(shí)現(xiàn)高效、低毒的基因轉(zhuǎn)染。本研究聚焦于多聚賴氨酸硅納米載體的制備及其體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染性能的研究，旨在為基因治療載體的發(fā)展提供新的思路和方法。

二、材料與方法

（一）材料

化學(xué)試劑
正硅酸乙酯（TEOS）、3 - 氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、多聚賴氨酸（PLL，不同分子量）、熒光標(biāo)記的質(zhì)粒 DNA（如綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒，pEGFP - N1）、細(xì)胞培養(yǎng)基（如 DMEM 培養(yǎng)基）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶 - EDTA 溶液、二甲基亞砜（DMSO）、磷酸鹽緩沖液（PBS）等。

細(xì)胞系
選用常用的體外細(xì)胞模型，如 HeLa 細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）或 293T 細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞）。

（二）多聚賴氨酸硅納米粒子的制備

硅納米粒子的合成
采用經(jīng)典的 St?ber 法合成硅納米粒子。在乙醇 - 水混合溶液中，加入氨水作為催化劑，緩慢滴加 TEOS。反應(yīng)方程式如下：

反應(yīng)在室溫下攪拌一定時(shí)間（如 2 - 4 小時(shí)），通過(guò)離心收集硅納米粒子，并用乙醇多次洗滌以去除雜質(zhì)。

硅納米粒子的氨基化
將合成的硅納米粒子分散于甲苯中，加入 APTES，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流反應(yīng)。APTES 的氨基與硅納米粒子表面的羥基發(fā)生反應(yīng)，使硅納米粒子表面帶有氨基。反應(yīng)式為：

反應(yīng)結(jié)束后，離心收集氨基化硅納米粒子，并用甲苯和乙醇依次洗滌。

多聚賴氨酸的偶聯(lián)
將氨基化硅納米粒子分散于 PBS 中，加入不同濃度的多聚賴氨酸溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)一定時(shí)間（如 12 - 24 小時(shí)）。多聚賴氨酸的氨基與氨基化硅納米粒子表面的氨基通過(guò)交聯(lián)劑（如戊二醛）進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。反應(yīng)式為：

反應(yīng)完成后，通過(guò)離心收集多聚賴氨酸硅納米粒子，并用 PBS 多次洗滌以去除未反應(yīng)的多聚賴氨酸。

（三）多聚賴氨酸硅納米粒子的表征

粒徑與電位測(cè)定
采用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)測(cè)定多聚賴氨酸硅納米粒子的粒徑大小和表面電位。將納米粒子分散于 PBS 中，在合適的測(cè)量角度和溫度下進(jìn)行測(cè)量。粒徑的大小影響納米粒子在細(xì)胞內(nèi)的攝取和分布，表面電位則與納米粒子與細(xì)胞的相互作用以及與核酸的結(jié)合能力密切相關(guān)。

形態(tài)觀察
利用透射電子顯微鏡（TEM）觀察多聚賴氨酸硅納米粒子的形態(tài)。將納米粒子分散于乙醇溶液中，滴加在銅網(wǎng)上，干燥后在 TEM 下觀察。TEM 圖像可以直觀地顯示納米粒子的形狀、大小和分散性。

紅外光譜分析
采用傅里葉變換紅外光譜（FT - IR）分析多聚賴氨酸硅納米粒子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過(guò)比較納米粒子在偶聯(lián)前后的紅外光譜圖，可以確定多聚賴氨酸是否成功偶聯(lián)到硅納米粒子上。例如，多聚賴氨酸的特征吸收峰（如酰胺鍵的吸收峰）在偶聯(lián)后的納米粒子光譜中出現(xiàn)，可作為成功偶聯(lián)的證據(jù)。

（四）體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)
將 HeLa 細(xì)胞或 293T 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，在含有 10% FBS 和 1% 青霉素 - 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中，于 37°C、5% CO? 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度（如 70 - 80% 匯合度）時(shí)，用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組
設(shè)置不同的轉(zhuǎn)染組，包括空白對(duì)照組（只加細(xì)胞和培養(yǎng)基）、陽(yáng)性對(duì)照組（使用已知的高效轉(zhuǎn)染試劑，如 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 DNA）、不同濃度的多聚賴氨酸硅納米粒子轉(zhuǎn)染組（如含有不同質(zhì)量濃度的納米粒子與固定量的質(zhì)粒 DNA 混合）。

轉(zhuǎn)染過(guò)程
將多聚賴氨酸硅納米粒子與熒光標(biāo)記的質(zhì)粒 DNA 按照一定比例（如質(zhì)量比為 1:1 - 10:1）在 PBS 中混合，室溫下孵育一定時(shí)間（如 30 分鐘），使納米粒子與質(zhì)粒 DNA 充分結(jié)合形成復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間（如 4 - 6 小時(shí)）。之后，更換為新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24 - 48 小時(shí)。

轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)
采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光蛋白表達(dá)情況，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。隨機(jī)選取多個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例。同時(shí)，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步定量分析轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來(lái)確定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的比例。

細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)
采用 MTT 法評(píng)價(jià)多聚賴氨酸硅納米粒子的細(xì)胞毒性。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（如 24、48、72 小時(shí)），向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入 MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 小時(shí)。然后吸出培養(yǎng)基，加入 DMSO 溶解結(jié)晶物，在酶標(biāo)儀上測(cè)定 570nm 處的吸光度值。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為：細(xì)胞存活率處理組吸光度值對(duì)照組吸光度值

三、結(jié)果與討論

（一）多聚賴氨酸硅納米粒子的表征結(jié)果

粒徑與電位
DLS 測(cè)量結(jié)果顯示，制備的多聚賴氨酸硅納米粒子粒徑在合適的范圍內(nèi)（如 50 - 200nm）。隨著多聚賴氨酸偶聯(lián)量的增加，粒徑略有增大，這可能是由于多聚賴氨酸分子的增加導(dǎo)致納米粒子表面增厚。納米粒子表面電位在偶聯(lián)多聚賴氨酸后呈現(xiàn)正電性，且電位值隨著多聚賴氨酸濃度的增加而增大，這有利于與帶負(fù)電的質(zhì)粒 DNA 結(jié)合。

形態(tài)觀察
TEM 圖像表明，多聚賴氨酸硅納米粒子呈球形，分散性良好，沒(méi)有明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。納米粒子的粒徑與 DLS 測(cè)量結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了制備方法的可靠性。

紅外光譜分析
FT - IR 光譜顯示，在偶聯(lián)多聚賴氨酸后，納米粒子在酰胺鍵特征吸收峰區(qū)域出現(xiàn)了新的吸收峰，這有力地證明了多聚賴氨酸成功地偶聯(lián)到了硅納米粒子上。

（二）體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

轉(zhuǎn)染效率
熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，多聚賴氨酸硅納米粒子具有一定的轉(zhuǎn)染效率。在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著納米粒子濃度的增加，轉(zhuǎn)染效率逐漸提高。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，雖然轉(zhuǎn)染效率略低，但在較低的細(xì)胞毒性下仍能實(shí)現(xiàn)可觀的基因轉(zhuǎn)染。不同分子量的多聚賴氨酸對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有影響，合適分子量的多聚賴氨酸制備的納米載體轉(zhuǎn)染效率更高，這可能與多聚賴氨酸與質(zhì)粒 DNA 的結(jié)合能力以及細(xì)胞攝取機(jī)制有關(guān)。

細(xì)胞毒性
MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多聚賴氨酸硅納米粒子在較低濃度下對(duì)細(xì)胞的毒性較小。隨著納米粒子濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率有所下降，但在合適的轉(zhuǎn)染條件下，細(xì)胞仍能保持較高的存活率。這表明所制備的納米載體具有較好的生物安全性，有利于其在基因治療中的應(yīng)用。

（三）討論

本研究成功制備了多聚賴氨酸硅納米粒子，并對(duì)其體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染性能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，這種新型納米載體在基因轉(zhuǎn)染方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。其良好的轉(zhuǎn)染效率可能歸因于多聚賴氨酸與質(zhì)粒 DNA 的有效結(jié)合以及硅納米粒子的合適粒徑和表面性質(zhì)，有利于細(xì)胞攝取。同時(shí)，相對(duì)較低的細(xì)胞毒性使其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有更大的潛力。然而，與傳統(tǒng)的高效轉(zhuǎn)染試劑相比，仍有進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率的空間。未來(lái)的研究可以從優(yōu)化納米粒子的制備工藝、進(jìn)一步調(diào)控表面性質(zhì)以及探索與其他功能分子的協(xié)同作用等方面入手，以進(jìn)一步提高多聚賴氨酸硅納米載體的轉(zhuǎn)染性能。

四、結(jié)論

本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)制備了多聚賴氨酸硅納米粒子，并對(duì)其進(jìn)行了全面的表征和體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，該納米粒子具有合適的粒徑、正電性表面和良好的生物相容性，在體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染中表現(xiàn)出一定的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性。盡管仍有改進(jìn)的空間，但本研究為開發(fā)新型、高效、安全的基因載體提供了有價(jià)值的參考，有望為基因治療領(lǐng)域帶來(lái)新的突破。