原位雜交（In situ hybridization，ISH）作為一種重要的分子生物學技術(shù)，能夠在細胞或組織水平上對特定的核酸序列進行定位和檢測。它為研究基因在染色體上的定位、特定組織中的表達模式以及疾病相關(guān)的基因變化等提供了有力手段。隨著科學研究的不斷深入，對原位雜交檢測的靈敏度和特異性要求越來越高。傳統(tǒng)的原位雜交方法在一些低表達基因或微量核酸樣本的檢測中可能存在局限性。
催化信號放大系統(tǒng)（Catalyzed signal amplification system）的出現(xiàn)為解決這些問題帶來了新的曙光。該系統(tǒng)能夠通過一系列的酶促反應(yīng)，對雜交信號進行顯著放大，從而使我們能夠更清晰、準確地檢測到目標核酸序列，即使在復(fù)雜的生物樣本環(huán)境中也能有效識別低豐度的核酸分子。這種技術(shù)的應(yīng)用不僅拓寬了原位雜交的適用范圍，而且在基因診斷、腫瘤研究、發(fā)育生物學等眾多領(lǐng)域都有著深遠的影響。
原位雜交技術(shù)是基于核酸分子的堿基互補配對原則。將標記有特定標記物（如放射性同位素、熒光素）的核酸探針與組織或細胞內(nèi)的靶核酸進行雜交。如果樣本中存在與探針互補的序列，探針就會與其特異性結(jié)合，然后通過檢測標記物來確定靶核酸的位置和表達情況。
對于放射性同位素標記的探針，可通過放射自顯影來檢測；對于非放射性標記的探針，如熒光標記的探針可直接在熒光顯微鏡下觀察，等標記的探針則需要通過相應(yīng)的免疫檢測方法結(jié)合顯色反應(yīng)來顯示信號。
催化信號放大系統(tǒng)主要利用了酶的催化活性。以常用的辣根過氧化物酶（HRP）為基礎(chǔ)的催化放大系統(tǒng)為例，在雜交完成后，與靶核酸結(jié)合的探針上連接有特定的底物結(jié)合位點。首先，加入與底物結(jié)合位點特異性結(jié)合的標記物 - 酶復(fù)合物（如 HRP 復(fù)合物），這些復(fù)合物會特異性地結(jié)合到探針上。然后，加入底物溶液，在 HRP 的催化作用下，底物發(fā)生化學反應(yīng)，產(chǎn)生一種可檢測的信號。
關(guān)鍵在于，HRP 可以持續(xù)催化底物反應(yīng)，一個酶分子在一定時間內(nèi)可以催化大量的底物分子發(fā)生反應(yīng)，從而實現(xiàn)信號的放大。而且，可以通過優(yōu)化反應(yīng)條件，如底物濃度、反應(yīng)時間等，進一步增強信號放大效果。此外，還有一些新型的催化信號放大系統(tǒng)利用了其他酶類和更好的底物 - 酶反應(yīng)機制，進一步提高了信號放大的效率和特異性。
樣本
探針
試劑
催化信號放大系統(tǒng)相關(guān)試劑，包括酶 - 標記物復(fù)合物（如 HRP 復(fù)合物）、底物溶液（如 3,3'- 二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液等用于 HRP 催化顯色反應(yīng)）。
原位雜交緩沖液、蛋白酶 K 溶液、多聚甲醛等固定液、洗滌緩沖液等常規(guī)原位雜交試劑。
樣本制備
對于組織切片，將新鮮采集的組織標本用多聚甲醛固定，然后經(jīng)過脫水、石蠟包埋等步驟制成石蠟切片。切片厚度一般為 4 - 6μm。在進行原位雜交前，將石蠟切片脫蠟至水，然后用蛋白酶 K 進行適當消化，以增加細胞膜和核膜的通透性，便于探針進入細胞內(nèi)與靶核酸結(jié)合。
對于細胞系，將培養(yǎng)的細胞用胰蛋白酶消化后，收集細胞，涂片或用細胞爬片的方式固定在載玻片上。同樣用多聚甲醛固定后，進行適當?shù)耐ㄍ柑幚怼?/p>
原位雜交
催化信號放大系統(tǒng)操作
加入與探針標記物特異性結(jié)合的酶 - 標記物復(fù)合物（標記的探針加入 HRP 復(fù)合物），在適宜的溫度（如 37°C）下孵育 30 - 60 分鐘，使復(fù)合物與探針充分結(jié)合。然后用洗滌緩沖液洗滌，去除未結(jié)合的復(fù)合物。
加入底物溶液進行顯色反應(yīng)。以 HRP - DAB 系統(tǒng)為例，在加入 DAB 底物溶液后，觀察顏色變化。反應(yīng)時間根據(jù)信號強度進行調(diào)整，一般為 5 - 30 分鐘?？梢栽陲@微鏡下實時觀察顯色情況，當達到合適的信號強度時，用蒸餾水終止反應(yīng)。
信號強度比較
特異性分析
不同樣本類型的應(yīng)用結(jié)果
在腫瘤研究中，原位雜交結(jié)合催化信號放大系統(tǒng)可用于檢測腫瘤相關(guān)基因的表達變化。例如，檢測癌基因（如 HER - 2、KRAS 等）的過表達和腫瘤抑制基因（如 p53、PTEN 等）的缺失或低表達。通過對腫瘤組織切片的分析，可以了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制，為腫瘤的診斷、分型和預(yù)后評估提供重要依據(jù)。此外，還可以用于檢測腫瘤細胞中的病毒核酸（如人乳頭瘤病毒（HPV）在宮頸癌中的檢測），有助于闡明病毒與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。
在胚胎發(fā)育過程中，基因的時空表達模式對于胚胎的正常發(fā)育至關(guān)重要。利用原位雜交結(jié)合催化信號放大系統(tǒng)，可以研究特定基因在胚胎不同發(fā)育階段、不同組織和器官中的表達情況。例如，研究神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因在胚胎腦發(fā)育過程中的表達，能夠幫助我們理解神經(jīng)系統(tǒng)的形成機制，以及相關(guān)基因在發(fā)育異常疾?。ㄈ缟窠?jīng)管缺陷等）中的作用。
在微生物感染的研究中，可以檢測病原體在宿主細胞內(nèi)的核酸存在情況。例如，在檢測結(jié)核分枝桿菌在肺部組織中的感染情況時，原位雜交結(jié)合催化信號放大系統(tǒng)能夠提高檢測的靈敏度，即使在低載量的病原體感染情況下也能準確檢測，有助于早期診斷和治療。同時，對于研究微生物在宿主內(nèi)的分布和與宿主細胞的相互作用也有重要意義。
高靈敏度
催化信號放大系統(tǒng)顯著提高了原位雜交檢測的靈敏度，使得低豐度的核酸序列能夠被有效檢測。這對于研究低表達基因、微量病原體核酸等具有重要意義，擴大了原位雜交技術(shù)的應(yīng)用范圍。
高特異性
通過合理設(shè)計探針和優(yōu)化實驗條件，該系統(tǒng)能夠保持很高的特異性，減少了假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。這對于準確的基因表達分析和疾病診斷至關(guān)重要。
廣泛適用性
適用于多種類型的樣本，包括不同組織來源的切片和各種細胞系。而且可以檢測多種類型的核酸（DNA 和 RNA），在不同的研究領(lǐng)域都有著出色的應(yīng)用表現(xiàn)。
背景噪音問題
在某些情況下，可能會出現(xiàn)一定程度的背景噪音，影響信號的清晰度。這可能是由于樣本處理不當、洗滌不充分或酶 - 標記物復(fù)合物的非特異性結(jié)合等原因?qū)е?。改進措施包括優(yōu)化樣本制備流程，增加洗滌次數(shù)和嚴格控制洗滌條件，以及篩選更優(yōu)質(zhì)的酶 - 標記物復(fù)合物。
復(fù)雜樣本中的干擾
在復(fù)雜的生物樣本（如含有大量雜質(zhì)的組織或混合細胞樣本）中，可能會存在一些干擾因素影響檢測結(jié)果?？梢酝ㄟ^進一步優(yōu)化雜交條件，如調(diào)整雜交緩沖液的成分、溫度和時間等，以及采用更特異性的探針設(shè)計來減少干擾。
催化信號放大系統(tǒng)在原位雜交檢測中的應(yīng)用為生物醫(yī)學研究帶來了新的突破。它通過增強檢測信號的靈敏度和特異性，在腫瘤研究、發(fā)育生物學、微生物學等眾多領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。盡管目前還存在一些局限性，但隨著技術(shù)的不斷改進和優(yōu)化，相信該系統(tǒng)將在未來的基因分析和疾病診斷等方面展現(xiàn)出更大的潛力，為生命科學研究和臨床實踐提供更準確、有效的檢測手段。
