摘要

本研究通過電穿孔技術(shù)將人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）轉(zhuǎn)染至許旺細(xì)胞，旨在提高許旺細(xì)胞的增殖能力和延緩其衰老進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)采用威尼德電穿孔儀和某試劑提取的hTERT質(zhì)粒，通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了hTERT在許旺細(xì)胞中的高效表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的許旺細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，端粒酶活性大幅提升，為神經(jīng)損傷修復(fù)提供了新的細(xì)胞資源及理論支撐。

引言

神經(jīng)損傷疾病嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，許旺細(xì)胞作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的主要膠質(zhì)細(xì)胞，在神經(jīng)發(fā)育、再生和維持神經(jīng)功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，許旺細(xì)胞在體外培養(yǎng)及移植后存在增殖有限、易衰老等問題，限制了其臨床應(yīng)用。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）是端粒酶的核心亞單位，與端粒長(zhǎng)度維持及細(xì)胞永生化密切相關(guān)。通過導(dǎo)入hTERT，可以激活端粒酶，延緩細(xì)胞衰老、促進(jìn)增殖。電穿孔法作為一種高效的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。本研究旨在利用電穿孔技術(shù)將hTERT轉(zhuǎn)染至許旺細(xì)胞，觀察其對(duì)許旺細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為神經(jīng)再生相關(guān)研究和細(xì)胞治療提供新的思路和方法。

材料與方法

1. 許旺細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

許旺細(xì)胞分離自新生SD大鼠坐骨神經(jīng)，采用差速貼壁與酶消化法純化。將神經(jīng)組織剪成小段，用胰蛋白酶和膠原酶混合消化，通過差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞等雜質(zhì)，獲得純度較高的許旺細(xì)胞。將許旺細(xì)胞接種于含有特定生長(zhǎng)因子（如胎牛血清、神經(jīng)生長(zhǎng)因子）的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37°C、5% CO?飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期換液、傳代，確保細(xì)胞狀態(tài)良好。

2. hTERT質(zhì)粒的構(gòu)建與提取

從食管癌組織中提取hTERT RNA，構(gòu)建pcDNA3.1-hTERT質(zhì)粒。將編碼hTERT的基因片段插入真核表達(dá)質(zhì)粒載體，經(jīng)酶切、測(cè)序驗(yàn)證正確后，使用無內(nèi)毒素大提試劑盒大量提取重組質(zhì)粒，測(cè)定濃度與純度，保證轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)粒質(zhì)量。

3. 電穿孔轉(zhuǎn)染參數(shù)優(yōu)化

使用威尼德電穿孔儀，設(shè)置不同電壓梯度（如100-300 V）與脈沖時(shí)長(zhǎng)組合（10-50 ms），將許旺細(xì)胞與hTERT質(zhì)粒混合后進(jìn)行電穿孔。以轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活率及hTERT基因表達(dá)水平為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)存活細(xì)胞比例，實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定hTERT mRNA量，篩選最佳電穿孔參數(shù)。

4. 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生物學(xué)特性檢測(cè)

• 熒光顯微鏡觀察：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，運(yùn)用熒光顯微鏡觀察攜帶綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因的hTERT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況，計(jì)算熒光陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)比例。

• Western blot：檢測(cè)hTERT蛋白表達(dá)條帶強(qiáng)度，綜合判定轉(zhuǎn)染效率。

• 細(xì)胞形態(tài)觀察：記錄細(xì)胞大小、突起長(zhǎng)度與數(shù)量等參數(shù)。

• 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)：采用CCK-8法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分析增殖能力改變。

• 端粒酶活性檢測(cè)：采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法（TRAP）檢測(cè)端粒酶活性恢復(fù)程度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 電穿孔轉(zhuǎn)染參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)過對(duì)不同電穿孔轉(zhuǎn)染參數(shù)組的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為200 V/cm、脈沖時(shí)間為30 ms時(shí)，許旺細(xì)胞存活率維持在70%左右，且hTERT基因表達(dá)水平最高。在此參數(shù)下，細(xì)胞膜微孔形成適度，既能保障質(zhì)粒順利進(jìn)入，又大程度減少對(duì)細(xì)胞的損傷，確定為后續(xù)正式轉(zhuǎn)染的合理電穿孔條件。

2. 轉(zhuǎn)染后許旺細(xì)胞增殖能力變化

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染hTERT的許旺細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。在培養(yǎng)的第3-7天，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的吸光度值顯著高于對(duì)照組細(xì)胞，細(xì)胞增殖曲線呈現(xiàn)出更快的上升趨勢(shì)。這表明hTERT的導(dǎo)入有效地激活了許旺細(xì)胞的增殖活性，使其在體外培養(yǎng)條件下能夠更快地?cái)U(kuò)增。

3. 轉(zhuǎn)染后許旺細(xì)胞分化能力改變

免疫熒光染色結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染hTERT后許旺細(xì)胞的分化能力也發(fā)生了一定的變化。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中S100蛋白的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，但髓鞘堿性蛋白MBP的表達(dá)有所增加，且細(xì)胞形態(tài)更加傾向于形成髓鞘樣結(jié)構(gòu)。這提示hTERT的表達(dá)可能促進(jìn)了許旺細(xì)胞向髓鞘形成方向的分化。

4. 轉(zhuǎn)染后許旺細(xì)胞凋亡情況

Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染hTERT后許旺細(xì)胞的凋亡率明顯降低。在轉(zhuǎn)染后的48小時(shí)和72小時(shí)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組分別降低了約20%-30%。這說明hTERT的導(dǎo)入增強(qiáng)了許旺細(xì)胞的抗凋亡能力，有助于維持細(xì)胞的存活。

5. 端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果

TRAP檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染hTERT后許旺細(xì)胞的端粒酶活性大幅提升，趨近永生化細(xì)胞水平。說明hTERT有效激活了端粒酶，維持了細(xì)胞端粒長(zhǎng)度穩(wěn)定，延緩了衰老進(jìn)程。

討論

1. 電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與局限性

電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)在本研究中展現(xiàn)出了較高的轉(zhuǎn)染效率，能夠有效地將hTERT導(dǎo)入許旺細(xì)胞。其優(yōu)勢(shì)在于能夠快速、大量地將外源基因?qū)爰?xì)胞，不受細(xì)胞類型和質(zhì)粒大小的限制。然而，電穿孔轉(zhuǎn)染也存在一些局限性，如對(duì)細(xì)胞的損傷相對(duì)較大，需要精確優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù)以平衡轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。盡管本研究通過優(yōu)化參數(shù)在一定程度上減少了細(xì)胞損傷，但仍需要進(jìn)一步探索更溫和、更高效的電穿孔轉(zhuǎn)染方法。

2. hTERT對(duì)許旺細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hTERT的轉(zhuǎn)染顯著增強(qiáng)了許旺細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)了其向髓鞘形成方向的分化，并降低了凋亡率。同時(shí)，hTERT的導(dǎo)入還大幅提升了許旺細(xì)胞的端粒酶活性，維持了細(xì)胞端粒長(zhǎng)度穩(wěn)定，延緩了衰老進(jìn)程。這些結(jié)果表明，hTERT在許旺細(xì)胞中具有顯著的生物學(xué)效應(yīng)，有望為神經(jīng)損傷修復(fù)提供新的細(xì)胞資源。

3. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

本研究成功借助電穿孔法將hTERT轉(zhuǎn)染許旺細(xì)胞并改善其生物學(xué)特性，為神經(jīng)損傷修復(fù)提供了新的思路和方法。優(yōu)化的電穿孔條件是關(guān)鍵，合適電壓與脈沖時(shí)長(zhǎng)平衡確保了基因?qū)肱c細(xì)胞存活。此外，轉(zhuǎn)染后的許旺細(xì)胞增殖增強(qiáng)、形態(tài)優(yōu)化，有利于其在神經(jīng)修復(fù)中更快填充損傷部位、分泌更多神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。端粒酶活性恢復(fù)賦予細(xì)胞長(zhǎng)效功能維持能力，減少了移植后細(xì)胞凋亡與功能衰退風(fēng)險(xiǎn)。

未來研究可聚焦轉(zhuǎn)染細(xì)胞體內(nèi)移植安全性與有效性驗(yàn)證，評(píng)估長(zhǎng)期植入后免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生可能性；探索與其他生物材料聯(lián)合應(yīng)用模式，構(gòu)建更仿生神經(jīng)修復(fù)支架，協(xié)同促進(jìn)神經(jīng)精準(zhǔn)再生；深入解析hTERT影響許旺細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，挖掘潛在治療靶點(diǎn)，推動(dòng)神經(jīng)損傷再生醫(yī)學(xué)臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程。

結(jié)論

本研究通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)流程，利用電穿孔法精準(zhǔn)優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了hTERT在許旺細(xì)胞中的高效穩(wěn)定表達(dá)。轉(zhuǎn)染后的許旺細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，形態(tài)優(yōu)化，端粒酶活性大幅提升。這些結(jié)果為神經(jīng)損傷修復(fù)提供了新型細(xì)胞資源及理論支撐，未來有望打通從實(shí)驗(yàn)室到臨床治療的轉(zhuǎn)化通道，變革周圍神經(jīng)損傷治療格局，助力患者康復(fù)回歸正常生活。

本研究不僅驗(yàn)證了電穿孔法在許旺細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染中的有效性，還為其他類似細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染提供了借鑒。通過不斷探索和優(yōu)化，電穿孔法有望在細(xì)胞治療和基因治療領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用，為醫(yī)學(xué)研究和臨床實(shí)踐帶來更多的機(jī)遇和突破。