摘要：
本文探討了電穿孔法轉(zhuǎn)染對人骨髓間充質(zhì)干細胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）生物學特性的影響。通過電穿孔法將增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因轉(zhuǎn)染至hBMSCs，并觀察其轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染后細胞的形態(tài)學、生長特性和分化潛能變化。結(jié)果顯示，電穿孔法轉(zhuǎn)染效率高，且對hBMSCs的生物學特性無明顯影響。

引言：
骨髓間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是干細胞家族的重要成員，因其具有自我復制和多向分化潛能而備受關注。MSCs在體外或體內(nèi)特定的誘導條件下，可分化為多種組織細胞，如脂肪、骨、軟骨等，具有廣闊的臨床應用前景?；蜣D(zhuǎn)染是將外源DNA導入細胞內(nèi)的常用技術(shù)，其中電穿孔法以其高轉(zhuǎn)染效率而被廣泛應用。然而，電穿孔法對人骨髓干細胞的生物學特性是否產(chǎn)生影響，仍需進一步探討。

一、理論闡述

1. 電穿孔法原理

電穿孔法是一種物理方法，利用短暫的高壓電流脈沖誘導活細胞產(chǎn)生跨膜電位。當外加電場強度大于細胞膜穿孔的臨界值時，細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生暫時性改變，形成納米級微孔，使DNA等外源物質(zhì)通過這些微孔進入細胞質(zhì)或細胞核。電穿孔法具有轉(zhuǎn)染效率高、操作簡便、對細胞類型依賴少等優(yōu)點，但也存在設備昂貴、對電壓和電脈沖條件要求嚴格等局限性。

2. 人骨髓間充質(zhì)干細胞特性

人骨髓間充質(zhì)干細胞（hBMSCs）具有自我復制和多向分化潛能，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉等多種組織細胞。hBMSCs在體內(nèi)或體外特定條件下，能夠持續(xù)保持其多向分化潛能，是組織工程和基因治療的理想種子細胞。此外，hBMSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能，能夠抑制免疫反應，減少移植排斥反應的發(fā)生。

3. 電穿孔法對hBMSCs的潛在影響

電穿孔法在將外源DNA導入hBMSCs時，可能會對其生物學特性產(chǎn)生影響，如細胞形態(tài)、生長速率、分化潛能等。細胞膜的穿孔可能導致細胞損傷，進而影響其存活和增殖能力。此外，電穿孔過程中產(chǎn)生的電場和電流可能對細胞的遺傳物質(zhì)造成損傷，導致基因突變或染色體異常。然而，已有研究表明，在合適的電壓和電脈沖條件下，電穿孔法對hBMSCs的生物學特性無明顯影響。

二、實驗部分

1. 實驗材料

• 細胞：健康人骨髓間充質(zhì)干細胞（hBMSCs）

• 試劑：某試劑（用于細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染等）

• 儀器：威尼德電穿孔儀、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、流式細胞儀等

2. 實驗方法

（1）細胞分離與培養(yǎng)：采用密度梯度離心法分離健康人骨髓中的MSCs，并進行常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2，使用完整培養(yǎng)基（含10%小牛血清）。

（2）電穿孔轉(zhuǎn)染：將hBMSCs培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用威尼德電穿孔儀進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，將細胞用PBS緩沖液洗滌兩次，并重新懸浮于1 ml PBS中。在細胞懸液中加入10 μl pEGFP-N1質(zhì)粒DNA（0.5~1 μg/μl），混勻后室溫下作用5 min。將DNA-細胞混合液移入滅菌的電擊池中，按照預實驗的結(jié)果選擇合適的電壓和脈沖時間進行電擊。電擊后，將DNA-細胞混合液在室溫下放置10 min，使其損傷恢復。然后，將細胞移至60 ml培養(yǎng)皿中，加入4 ml完整培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

（3）轉(zhuǎn)染效率檢測：在轉(zhuǎn)染后24 h，使用熒光顯微鏡觀察hBMSCs中EGFP的表達情況，并使用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

（4）細胞形態(tài)與生長特性觀察：在轉(zhuǎn)染前后，使用倒置顯微鏡觀察hBMSCs的形態(tài)學變化。同時，取第5代未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后24 h的hBMSCs，繪制細胞生長曲線，比較其生長速率。

（5）細胞亞型檢測：使用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后hBMSCs的亞型，包括CD44、CD105和CD45的表達情況。

（6）分化潛能檢測：對轉(zhuǎn)染前后的hBMSCs進行成脂和成骨誘導分化培養(yǎng)，使用油紅O和茜素紅染色觀察誘導分化結(jié)果。

3. 實驗結(jié)果

（1）轉(zhuǎn)染效率：在轉(zhuǎn)染后24 h，熒光顯微鏡下觀察到hBMSCs中有綠色熒光出現(xiàn)，表明EGFP基因已成功導入細胞。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染效率為（48.65±11.23）%。

（2）細胞形態(tài)與生長特性：分離培養(yǎng)的hBMSCs形態(tài)均一，呈梭形或紡錘形。轉(zhuǎn)染前后，細胞形態(tài)無明顯差異。同時，轉(zhuǎn)染前后的細胞生長曲線也無顯著差異，表明電穿孔法對hBMSCs的生長速率無明顯影響。

（3）細胞亞型：流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染前后hBMSCs的CD44及CD105陽性率均在99%以上，不表達CD45，符合MSCs的特征。轉(zhuǎn)染后hBMSCs的表型未見明顯變化。

（4）分化潛能：對轉(zhuǎn)染前后的hBMSCs進行成脂和成骨誘導分化培養(yǎng)后，油紅O和茜素紅染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染前后的細胞均可形成成脂細胞和成骨細胞。這表明電穿孔法對hBMSCs的分化潛能無明顯影響。

三、結(jié)論

本研究采用電穿孔法將EGFP基因轉(zhuǎn)染至人骨髓間充質(zhì)干細胞（hBMSCs），并觀察了轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染后細胞的形態(tài)學、生長特性和分化潛能變化。結(jié)果顯示，電穿孔法可使EGFP獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，且轉(zhuǎn)染后的hBMSCs生物學特性未發(fā)生改變。這表明電穿孔法是一種安全有效的基因轉(zhuǎn)染方法，可用于hBMSCs的基因治療和組織工程研究。

電穿孔法轉(zhuǎn)染hBMSCs的成功，為進一步的基因治療和細胞治療提供了有力支持。通過電穿孔法將治療基因?qū)雋BMSCs，可以使其在體內(nèi)持續(xù)表達并發(fā)揮治療作用。同時，hBMSCs的多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)功能使其成為組織工程和細胞治療的理想種子細胞。未來的研究將進一步探索電穿孔法在基因治療和組織工程中的應用潛力，為臨床治療提供更多有效的手段。

此外，本研究還表明，電穿孔法的轉(zhuǎn)染效率受多種因素影響，如電壓、電脈沖時間、細胞狀態(tài)等。因此，在進行電穿孔法轉(zhuǎn)染時，需要進行預實驗以確定最佳轉(zhuǎn)染條件。同時，不同細胞類型對電穿孔法的耐受性也不同，因此在應用電穿孔法進行基因轉(zhuǎn)染時，需要根據(jù)細胞類型選擇合適的電壓和電脈沖條件。

綜上所述，電穿孔法是一種安全有效的基因轉(zhuǎn)染方法，可用于人骨髓間充質(zhì)干細胞的基因治療和組織工程研究。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件和提高轉(zhuǎn)染效率，電穿孔法將為臨床治療和科學研究提供更多有力的支持。