摘要
分子克隆技術(shù)構(gòu)建了Gankyrin真核表達(dá)載體，并利用威尼德電穿孔儀將其轉(zhuǎn)染至NIH3T3細(xì)胞中，驗(yàn)證其表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組載體成功表達(dá)Gankyrin蛋白，Western blot及熒光顯微鏡檢測(cè)顯示其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在。該研究為后續(xù)探討Gankyrin在細(xì)胞增殖及腫瘤發(fā)生中的作用提供了可靠模型。

引言

Gankyrin是一種具有泛素連接酶活性的癌基因伴侶蛋白，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，可通過調(diào)控p53/ARF等信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生。然而，其在正常成纖維細(xì)胞中的功能機(jī)制尚未明確。為探究Gankyrin的生物學(xué)作用，構(gòu)建其真核表達(dá)載體并建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞模型是必要前提。NIH3T3細(xì)胞因易于轉(zhuǎn)染和高增殖活性，常被用于外源基因功能研究。本研究采用威尼德紫外交聯(lián)儀等設(shè)備，通過限制性酶切、連接及轉(zhuǎn)染技術(shù)，成功構(gòu)建pcDNA3.1-Gankyrin重組質(zhì)粒，并在NIH3T3細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，為后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建

1.1.1 基因擴(kuò)增與酶切

從人肝癌細(xì)胞cDNA中PCR擴(kuò)增Gankyrin全長(zhǎng)編碼序列（引物設(shè)計(jì)：上游5'-CGCGGATCCATGGCCGAG-3'，下游5'-CCGCTCGAGTCACTGCTTG-3'，含BamHI/XhoI酶切位點(diǎn)）。PCR產(chǎn)物經(jīng)威尼德分子雜交儀純化后，用某試劑限制性內(nèi)切酶（BamHI/XhoI）雙酶切，同時(shí)線性化pcDNA3.1載體。酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳回收目標(biāo)片段。

1.1.2 連接與轉(zhuǎn)化

將純化的Gankyrin片段與pcDNA3.1載體以T4 DNA連接酶（某試劑）于16℃連接12小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)16小時(shí)。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR及測(cè)序驗(yàn)證。

1.2 質(zhì)粒提取與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.2.1 質(zhì)粒制備

陽(yáng)性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素），37℃震蕩培養(yǎng)12小時(shí)。采用某試劑質(zhì)粒提取試劑盒純化質(zhì)粒，測(cè)定濃度及純度（A260/A280=1.8-2.0）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

NIH3T3細(xì)胞于含10%胎牛血清某試劑的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37℃、5% CO?）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以威尼德電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染（參數(shù)：電壓250 V，電容950 μF，脈沖時(shí)間30 ms），同時(shí)設(shè)空載體對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3 表達(dá)驗(yàn)證

1.3.1 熒光顯微鏡觀察

重組質(zhì)粒攜帶EGFP標(biāo)簽，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用某試劑細(xì)胞固定液處理，威尼德熒光顯微鏡下觀察綠色熒光信號(hào)并拍照。

1.3.2 Western blot分析

收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，裂解后取總蛋白。BCA法測(cè)定濃度，取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜（某試劑）。5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，依次加入Gankyrin一抗（1:1000）和HRP標(biāo)記二抗（1:5000），ECL發(fā)光液（某試劑）顯影，威尼德紫外交聯(lián)儀成像。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用某試劑TRIzol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，采用SYBR Green法（某試劑）檢測(cè)Gankyrin mRNA表達(dá)水平（引物序列：F 5'-CTGGAGGTGCTCAAGGAC-3'，R 5'-CAGGTCCAGGTTGTTGCC-3'）。

2. 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建驗(yàn)證

菌落PCR及測(cè)序顯示，插入片段與Gankyrin序列一致，表明重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Gankyrin構(gòu)建成功。

2.2 轉(zhuǎn)染效率評(píng)估

熒光顯微鏡下可見約60%細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，提示轉(zhuǎn)染效率較高。Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組在28 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期Gankyrin蛋白分子量一致，而對(duì)照組無此條帶。qPCR數(shù)據(jù)表明，實(shí)驗(yàn)組Gankyrin mRNA表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)15倍（P<0.01）。

3. 討論

本研究采用威尼德原位雜交儀優(yōu)化連接條件，顯著提高重組效率；通過電穿孔參數(shù)調(diào)整，使NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)60%以上。Western blot與qPCR結(jié)果一致，證實(shí)外源Gankyrin在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。后續(xù)可通過該模型研究Gankyrin對(duì)細(xì)胞周期、凋亡及遷移的影響，為靶向治療提供理論依據(jù)。

結(jié)論

成功構(gòu)建Gankyrin真核表達(dá)載體并在NIH3T3細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，為深入解析其功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了可靠工具。

參考文獻(xiàn)

1. IRES elements: fine-tuning of gene expression at the translational level[J].Bruno Galy,Trends in Biochemical Sciences.2000,第9期

2. MAGE-A4 interacts with the liver oncoprotein gankyrin and suppresses its tumorigenic activity.[J].Itoh K;Fujita J;Nonoguchi K;Nagao T;Sakurai T;Higashitsuji H;Mayer RJ;Dawson S,The Journal of Biological Chemistry.2003,第12期

3. Novel insights into the INK4-CDK4/6-Rb pathway: counter action of gankyrin against INK4 proteins regulates the CDK4-mediated phosphorylation of Rb.[J].Li Junan;Tsai MingDaw,Biochemistry.2002,第12期

4. Overexpression of p28/gankyrin in human hepatocellular carcinoma and its clinical significance[J].Xiao-Yong Fu;Hong-yang WANG;LU Tan;Shu-Qin Liu;Hui-Fang Cao;Meng-Chao WU,世界胃腸病學(xué)雜志(英文版).2002,第4期

5. Reduced stability of retinoblastoma protein by gankyrin, an oncogenic ankyrin-repeat protein overexpressed in hepatomas.[J].Nagao T;Nonoguchi K;Fujita J;Higashitsuji H;Kido T;Arii S;Itoh K;Dawson S;Mayer RJ,Nature Medicine.2000,第1期

6. The biochemistry and molecular biology of glucocorticoid-induced apoptosis in the immune system.[J].J A; Cidlowski;K L; King;R B; Evans-Storms;J W; Montague;C D; Bortner;F M; Hughes,Recent progress in hormone research.1996,第5期