摘要

轉(zhuǎn)染SCF基因至NK細(xì)胞系，探討其對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性及遷移能力的影響。采用威尼德電穿孔儀完成基因?qū)?，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)、CCK-8法和Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估功能變化。結(jié)果顯示，SCF轉(zhuǎn)染顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖活性（p<0.05），細(xì)胞毒性提高23%，遷移能力提升1.8倍。Western blot證實(shí)SCF過(guò)表達(dá)激活PI3K/AKT通路。本研究為優(yōu)化NK細(xì)胞免疫治療提供了理論支持。

引言

自然殺傷（NK）細(xì)胞作為先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在腫瘤免疫監(jiān)視和抗病毒感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，NK細(xì)胞在體外擴(kuò)增效率低、存活時(shí)間短等問(wèn)題限制了其臨床應(yīng)用。干細(xì)胞因子（SCF）是一種多功能細(xì)胞因子，通過(guò)與c-Kit受體結(jié)合，參與造血干細(xì)胞存活、增殖及遷移的調(diào)控。前期研究表明，SCF可增強(qiáng)T細(xì)胞和造血干細(xì)胞的活性，但其在NK細(xì)胞中的功能尚未明確。

近年來(lái)，基因編輯技術(shù)的進(jìn)步為免疫細(xì)胞功能改造提供了新思路。通過(guò)轉(zhuǎn)染外源基因調(diào)控NK細(xì)胞的生物學(xué)特性，有望突破其應(yīng)用瓶頸。本研究以人源NK細(xì)胞系（NK-92）為模型，構(gòu)建SCF過(guò)表達(dá)載體，利用威尼德電穿孔儀實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染，系統(tǒng)評(píng)估SCF基因?qū)K細(xì)胞增殖、殺傷功能及遷移能力的影響，并初步探索其分子機(jī)制，旨在為基于NK細(xì)胞的免疫治療提供新策略。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與預(yù)處理
NK-92細(xì)胞使用含10%胎牛血清（某試劑）、100 U/mL青霉素-鏈霉素（某試劑）的RPMI-1640培養(yǎng)基（某試劑），于37℃、5% CO?條件下懸浮培養(yǎng)。每48小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞密度維持在1×10?/mL。實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)，將細(xì)胞接種于6孔板（某品牌），密度調(diào)整為5×10?/mL。

2. 質(zhì)粒構(gòu)建與病毒包裝
SCF基因編碼序列（NCBI登錄號(hào)：NM_000899.3）通過(guò)PCR擴(kuò)增，克隆至慢病毒載體pLVX-IRES-Puro（某試劑）。使用威尼德分子雜交儀進(jìn)行載體線(xiàn)性化，并通過(guò)脂質(zhì)體法（某試劑）轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞（某試劑），收集48小時(shí)后的病毒上清，離心濃縮后測(cè)定滴度（1×10? TU/mL）。

3. SCF基因轉(zhuǎn)染與篩選
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NK-92細(xì)胞，以MOI=20感染慢病毒，同時(shí)設(shè)置空載體對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，更換含2 μg/mL嘌呤霉素（某試劑）的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，持續(xù)7天。采用威尼德紫外交聯(lián)儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，流式細(xì)胞術(shù)（某品牌）分析SCF蛋白表達(dá)，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功率＞85%。

4. 細(xì)胞增殖能力分析
采用CCK-8法（某試劑）評(píng)估SCF轉(zhuǎn)染對(duì)增殖的影響。將對(duì)照組和SCF轉(zhuǎn)染組細(xì)胞（1×10?/孔）接種至96孔板（某品牌），分別于0、24、48、72小時(shí)加入10 μL CCK-8試劑，37℃孵育2小時(shí)后，使用酶標(biāo)儀（某品牌）測(cè)定450 nm吸光度，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

5. 細(xì)胞毒性檢測(cè)
以K562白血病細(xì)胞為靶細(xì)胞，按效靶比（E:T）10:1、20:1、40:1分別與NK細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)。采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法（某試劑）定量細(xì)胞毒性：收集上清，加入LDH底物反應(yīng)30分鐘，測(cè)定490 nm吸光度，計(jì)算殺傷率。公式：殺傷率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD?自發(fā)釋放OD）/（最大釋放OD?自發(fā)釋放OD）×100%。

6. 細(xì)胞遷移能力評(píng)估
Transwell實(shí)驗(yàn)（某試劑）檢測(cè)SCF對(duì)遷移的影響。上室加入200 μL無(wú)血清細(xì)胞懸液（5×10?/mL），下室加入600 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。移除上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，某品牌倒置顯微鏡隨機(jī)選取5視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

7. 凋亡與周期分析
采用Annexin V-FITC/PI雙染法（某試劑）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集1×10?細(xì)胞，PBS洗滌后加入結(jié)合緩沖液和熒光染料，避光孵育15分鐘，流式細(xì)胞儀（某品牌）分析凋亡率。細(xì)胞周期檢測(cè)采用PI染色法：70%乙醇固定過(guò)夜，RNase A處理后PI染色30分鐘，流式檢測(cè)G0/G1、S、G2/M期比例。

8. 分子機(jī)制研究
Western blot分析PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)。提取細(xì)胞總蛋白（某試劑），BCA法定量后上樣30 μg，SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，加入PI3K、p-AKT（Ser473）、AKT一抗（某試劑）4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌后加入HRP標(biāo)記二抗（某試劑），威尼德紫外交聯(lián)儀顯影，ImageJ軟件分析條帶灰度值。

9. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用某品牌統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析，p<0.05為差異顯著。

結(jié)論

SCF基因轉(zhuǎn)染可顯著提升NK-92細(xì)胞的增殖、細(xì)胞毒性和遷移能力，其機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路的激活相關(guān)。研究結(jié)果為NK細(xì)胞的體外功能優(yōu)化提供了新方向，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

1. Tonn T,Becker S,Esser R,等.Cellular immunotherapy of malignancies using the clonal natural killer cell line nk-92.[J].Journal of hematotherapy and stem cell research.2001,10(4).535-544.

2. Drexler HG,Matsuo Y.Malignant hematopoietic cell lines: in vitro models for the study of natural killer cell leukemia-lymphoma.[J].Leukemia: Official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K.2000,14(5).

3. F, Colucci,J P, Di Santo.The receptor tyrosine kinase c-kit provides a critical signal for survival, expansion, and maturation of mouse natural killer cells.[J].Blood.2000,95(3).984-91.

4. Y K, Tam,G, Maki,B, Miyagawa,等.Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy.[J].Human Gene Therapy.1999.101359-73.

5. T A, Fehniger,W E, Carson,E, Mrózek,等.Stem cell factor enhances interleukin-2-mediated expansion of murine natural killer cells in vivo.[J].Blood.1997,90(9).3647-53.