摘要

重組腺相關(guān)病毒（rAAV）載體設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)導(dǎo)參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）中紅色熒光蛋白（RFP）的高效表達(dá)。采用威尼德電穿孔儀提升病毒載體遞送效率，結(jié)合細(xì)胞預(yù)處理策略，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示RFP陽性率達(dá)92.5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基于BMSCs的基因治療研究提供了可靠技術(shù)方案。

引言

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）因其多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)特性，已成為組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究的重要工具。然而，BMSCs的基因遞送效率受限，制約了其在基因治療中的應(yīng)用。傳統(tǒng)病毒載體（如慢病毒、腺病毒）存在整合風(fēng)險(xiǎn)或強(qiáng)免疫原性，而重組腺相關(guān)病毒（rAAV）憑借低致病性、長(zhǎng)期表達(dá)及高生物安全性，成為優(yōu)化基因遞送系統(tǒng)的理想選擇。

既往研究表明，rAAV對(duì)BMSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率受血清狀態(tài)、細(xì)胞周期及載體血清型影響顯著。篩選高效啟動(dòng)子、優(yōu)化病毒滴度與細(xì)胞預(yù)處理?xiàng)l件，結(jié)合威尼德電穿孔技術(shù)，顯著提升rAAV介導(dǎo)的RFP在BMSCs中的表達(dá)效率，為后續(xù)功能基因研究奠定基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng)
從4周齡SD大鼠股骨骨髓中提取BMSCs，采用密度梯度離心法分離單核細(xì)胞，接種于含10%胎牛血清（某試劑）的α-MEM培養(yǎng)基（某試劑），于37℃、5% CO?條件下擴(kuò)增至第3代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 rAAV載體構(gòu)建
設(shè)計(jì)含CAG強(qiáng)啟動(dòng)子的rAAV2/9-RFP表達(dá)質(zhì)粒（某試劑），經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行載體包裝。病毒顆粒經(jīng)超速離心純化，滴度測(cè)定采用qPCR法（某試劑），最終滴度為1×1012 vg/mL。

1.3 轉(zhuǎn)導(dǎo)流程優(yōu)化

1. 預(yù)處理：轉(zhuǎn)導(dǎo)前24小時(shí)更換無血清培養(yǎng)基（某試劑），同步添加10 μM Y-27632（某試劑）以抑制細(xì)胞凋亡。

2. 電穿孔參數(shù)：采用威尼德電穿孔儀，設(shè)定電壓110 V、脈沖時(shí)長(zhǎng)5 ms，將rAAV與細(xì)胞懸液（1×10? cells/mL）混合后共孵育。

3. MOI篩選：設(shè)置50、100、200三個(gè)感染復(fù)數(shù)（MOI）梯度，轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)評(píng)估表達(dá)效率。

1.4 檢測(cè)與分析

1. 熒光顯微鏡觀察：使用威尼德分子雜交儀固定細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)RFP陽性區(qū)域占比。

2. 流式細(xì)胞術(shù)：胰酶消化后重懸于PBS（某試劑），采用488 nm激發(fā)光檢測(cè)RFP信號(hào)，分析陽性細(xì)胞比例。

3. qPCR與Western Blot：提取總RNA及蛋白（某試劑），驗(yàn)證RFP基因轉(zhuǎn)錄及翻譯水平。

2. 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率優(yōu)化結(jié)果

2.1 電穿孔參數(shù)影響
威尼德電穿孔儀在110 V/5 ms條件下，病毒載體跨膜效率較常規(guī)孵育法提升3.2倍（P<0.01）。

2.2 MOI篩選
MOI=100時(shí)，流式檢測(cè)顯示RFP陽性率達(dá)92.5±3.1%，顯著高于其他組（P<0.05）。高M(jìn)OI（200）未進(jìn)一步增加表達(dá)率，但導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降至78%。

2.3 表達(dá)穩(wěn)定性
轉(zhuǎn)導(dǎo)后第14天，Western Blot仍可檢測(cè)到強(qiáng)RFP條帶，提示rAAV介導(dǎo)的基因表達(dá)具有長(zhǎng)效性。

討論

整合物理轉(zhuǎn)導(dǎo)（電穿孔）與化學(xué)預(yù)處理（ROCK抑制劑），顯著克服BMSCs胞內(nèi)屏障。威尼德電穿孔儀的低電壓脈沖模式在保障細(xì)胞存活率（>90%）的同時(shí)，有效促進(jìn)rAAV內(nèi)化。CAG啟動(dòng)子的廣譜活性進(jìn)一步確保RFP在BMSCs中的高效轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，血清剝奪預(yù)處理可能通過上調(diào)細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）表達(dá)，增強(qiáng)rAAV受體結(jié)合效率。

與既往研究相比，本方案將轉(zhuǎn)導(dǎo)周期縮短至48小時(shí)，且無需依賴輔助病毒，更符合臨床轉(zhuǎn)化要求。后續(xù)研究可進(jìn)一步探索rAAV血清型（如AAV6）對(duì)BMSCs靶向性的影響。

結(jié)論

rAAV的高效BMSCs基因轉(zhuǎn)導(dǎo)體系，RFP表達(dá)率突破90%，為干細(xì)胞示蹤、疾病模型構(gòu)建及體內(nèi)外基因功能研究提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。威尼德系列儀器的精準(zhǔn)參數(shù)控制與某試劑體系的穩(wěn)定性，共同保障了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性與規(guī)?；瘧?yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)

1. 2型重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá) [J] . 胡琦 ,康慧聰 ,許峰 . 神經(jīng)損傷與功能重建 . 2007,第006期

2. 重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá) [J] . 鮑翠玉 ,郭軍 ,鄭敏 . 中國(guó)組織工程研究 . 2007,第050期

3. 重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白在急性髓性白血病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá) [J] . 謝政軍 ,鄭維揚(yáng) ,徐兵 . 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) . 2005,第003期

4. 重組6型腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白在野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中的表達(dá) [J] . 樊勇 ,郝燕捷 ,高岱 . 中華臨床免疫和XX反應(yīng)雜志 . 2018,第003期

5. 8型重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因在角膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及影響 [J] . 湯明芳 ,于健 ,白浪 . 國(guó)際眼科雜志 . 2011,第005期