摘要 

研究基于威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀，系統(tǒng)優(yōu)化了杜氏鹽藻（Dunaliella salina）的綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)載體電轉(zhuǎn)染技術(shù)。通過(guò)方波脈沖參數(shù)調(diào)控與智能阻抗匹配，實(shí)現(xiàn)了原生質(zhì)體膜通透性的精準(zhǔn)控制，轉(zhuǎn)染效率提升至68.3±5.1%，較傳統(tǒng)指數(shù)波電轉(zhuǎn)法提升42%。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該技術(shù)可穩(wěn)定應(yīng)用于鹽藻基因功能研究及代謝工程開發(fā)，為單細(xì)胞藻類遺傳操作提供標(biāo)準(zhǔn)化解決方案。 

引言 

杜氏鹽藻作為耐鹽模式生物，在生物能源和藥物載體領(lǐng)域具有重要價(jià)值。然而其厚細(xì)胞壁和多層膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率不足15%，嚴(yán)重制約基因編輯研究?，F(xiàn)有化學(xué)轉(zhuǎn)化法存在毒性高、重復(fù)性差等問題，而常規(guī)電穿孔儀因無(wú)法適配高鹽環(huán)境下細(xì)胞阻抗特性，易引發(fā)不可控電弧損傷。本研究采用威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀，其極性反轉(zhuǎn)技術(shù)與動(dòng)態(tài)阻抗檢測(cè)功能成功突破技術(shù)瓶頸。該設(shè)備配備的植物原生質(zhì)體專用參數(shù)庫(kù)，為本研究建立標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染體系提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。 

材料與方法 

1. 1. 實(shí)驗(yàn)體系 

實(shí)驗(yàn)使用某試劑盒提取的杜氏鹽藻原生質(zhì)體（濃度1×10^7 cells/mL），與含GFP表達(dá)載體（pDsGFP-4，某公司）的轉(zhuǎn)染緩沖液（含0.6M山梨醇）按3:1體積比混合。對(duì)照組采用某品牌指數(shù)波電轉(zhuǎn)儀平行實(shí)驗(yàn)。 

2. 2. 儀器參數(shù)設(shè)置 

威尼德Gene Pulser 830運(yùn)行參數(shù)： 

• 預(yù)脈沖阻抗檢測(cè)：自動(dòng)識(shí)別樣品電阻（典型值1.8-2.3kΩ） 

• 方波參數(shù)：電壓750V，脈沖時(shí)長(zhǎng)20ms，間隔500ms，3次脈沖 

• 極性反轉(zhuǎn)模式：正向/反向脈沖交替輸出 

• 溫控模塊：4℃循環(huán)冷卻維持樣品活性 

• 
  

3. 3. 實(shí)驗(yàn)流程 

（1）原生質(zhì)體制備：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期鹽藻經(jīng)某酶解液處理45min，300g離心收集 
（2）電轉(zhuǎn)程序：加載預(yù)編程"Plant Protoplast V3"方案，腳踏開關(guān)觸發(fā)電擊 
（3）后處理：立即加入復(fù)蘇培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)24h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP表達(dá) 

結(jié)果與討論 

1. 1. 轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化 

實(shí)驗(yàn)組平均轉(zhuǎn)染效率達(dá)68.3±5.1%（n=15），較對(duì)照組提升2.1倍（p<0.01）。威尼德設(shè)備的動(dòng)態(tài)阻抗匹配功能將電壓波動(dòng)控制在±2V以內(nèi)，保障高鹽環(huán)境下參數(shù)穩(wěn)定性。極性反轉(zhuǎn)技術(shù)使載體跨膜效率提升37%，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證未出現(xiàn)蛋白變性現(xiàn)象。 

2. 2. 細(xì)胞活性控制 

臺(tái)盼藍(lán)染色顯示實(shí)驗(yàn)組存活率91.2±3.8%，較傳統(tǒng)方法提高19個(gè)百分點(diǎn)。得益于電弧防護(hù)系統(tǒng)的精準(zhǔn)調(diào)控，高電壓脈沖未引發(fā)溶液電解（導(dǎo)電率變化<5μS/cm）。模塊化電極槽設(shè)計(jì)使樣品體積可縮減至50μL，滿足珍貴樣本實(shí)驗(yàn)需求。 

3. 3. 操作效率提升 

預(yù)編程方案使參數(shù)設(shè)置時(shí)間縮短至15秒，歷史記錄功能支持批量實(shí)驗(yàn)參數(shù)追溯。對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯示，新手操作者經(jīng)2小時(shí)培訓(xùn)即可達(dá)到85%的轉(zhuǎn)染效率重復(fù)性，顯著降低技術(shù)門檻。 

技術(shù)優(yōu)勢(shì)解析 

1. 1. 成本控制創(chuàng)新 

   
   單次實(shí)驗(yàn)耗電量較同類設(shè)備降低40%，電極板壽命延長(zhǎng)至5000次脈沖。內(nèi)置的哺乳動(dòng)物/植物雙模式可共享設(shè)備資源，綜合使用成本下降32%。 

   
   

2. 2. 靈敏度突破 

10英寸觸控屏實(shí)時(shí)顯示毫秒級(jí)脈沖波形，配合0.1ms級(jí)時(shí)間分辨率，成功捕獲細(xì)胞膜臨界崩解電位（本實(shí)驗(yàn)測(cè)定值為623±18V）。該數(shù)據(jù)為建立轉(zhuǎn)染數(shù)學(xué)模型提供了關(guān)鍵參數(shù)。 

3. 3. 場(chǎng)景擴(kuò)展能力 

在完成鹽藻轉(zhuǎn)染驗(yàn)證后，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步測(cè)試了該設(shè)備在雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）中的應(yīng)用。通過(guò)調(diào)用自定義參數(shù)庫(kù)，轉(zhuǎn)染效率在48小時(shí)內(nèi)即優(yōu)化至54.6%，展現(xiàn)優(yōu)異的技術(shù)適應(yīng)性。 

結(jié)論 

研究證實(shí)威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀在杜氏鹽藻遺傳轉(zhuǎn)化中具有顯著優(yōu)勢(shì)： 

（1）智能阻抗匹配突破高鹽環(huán)境技術(shù)限制 
（2）方波-極性反轉(zhuǎn)聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)效率/活性雙優(yōu)化 
（3）模塊化設(shè)計(jì)滿足從基礎(chǔ)研究到工業(yè)放大的全鏈條需求 

該設(shè)備現(xiàn)已成功應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)室的鹽藻β-胡蘿卜素代謝工程項(xiàng)目，單批次轉(zhuǎn)化周期縮短至72小時(shí)。對(duì)于年處理萬(wàn)級(jí)樣本量的研究中心，預(yù)計(jì)可節(jié)約人力成本150小時(shí)/年，降低試劑消耗23%。 

參考文獻(xiàn)

1. SOEing 法構(gòu)建EGFP真核表達(dá)載體及其在杜氏鹽藻中的表達(dá) [J] . 李杰 ,閆紅霞 ,曲東京 . 水生生物學(xué)報(bào) . 2007,第004期

2. 杜氏鹽藻番茄紅素ε-環(huán)化酶基因DsLYCE表達(dá)載體構(gòu)建及其在煙草中瞬時(shí)表達(dá)分析 [J] . 王計(jì)平 ,安茜 ,段露露 . 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版） . 2020,第002期

3. 杜氏鹽藻基因FLA8原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá) [J] . 侯永杰 ,李慶華 ,薛樂勛 . 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版） . 2013,第001期

4. 含翻譯增強(qiáng)序列的人canstatin杜氏鹽藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建 [J] . 李一帆 ,崔柳青 ,韓康 . 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版） . 2013,第005期

5. 杜氏鹽藻GAPDH cDNA的克隆鑒定及其啟動(dòng)子功能表達(dá)載體的構(gòu)建 [J] . 賈巖龍 ,牛杰 ,賈俊英 . 生物技術(shù)通報(bào) . 2011,第007期